Stoffwechselanpassung an die Vitamin-Auxotrophie durch Blätter

The ISME Journal Band 16, Seiten 2712–2724 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Auxotrophe Menschen sind nicht in der Lage, alle für ihren Stoffwechsel wesentlichen Metaboliten zu synthetisieren und sind auf die Bereitstellung durch andere angewiesen. Sie wurden intensiv an im Labor erzeugten und weiterentwickelten Mutanten untersucht, neu auftretende Anpassungsmechanismen an die Auxotrophie wurden jedoch nicht systematisch untersucht. Hier untersuchten wir Auxotrophien in Bakterien, die aus Blättern von Arabidopsis thaliana isoliert wurden, und stellten fest, dass bis zur Hälfte der Stämme einen auxotrophen Bedarf an Biotin, Niacin, Pantothenat und/oder Thiamin haben. Anschließend untersuchten wir die genetischen Grundlagen der Auxotrophie sowie Merkmale, die gleichzeitig mit der Vitamin-Auxotrophie auftraten. Wir fanden heraus, dass auxotrophe Stämme im Allgemeinen Coenzyme mit der Fähigkeit speicherten, für 1–3 Verdoppelungen ohne Vitaminergänzung exponentiell zu wachsen; Die höchste beobachtete Speicherung war jedoch für Biotin zu verzeichnen, was 9 Verdoppelungen in einem Stamm ermöglichte. In Co-Kultur-Experimenten haben wir die Vitaminversorgung von Auxotrophen nachgewiesen und festgestellt, dass auxotrophe Stämme nach externer Vitaminergänzung einen höheren Artenreichtum aufrechterhielten als Prototrophe. Die Erweiterung eines Verbraucher-Ressourcen-Modells sagte voraus, dass Auxotrophe Kohlenstoffverbindungen anderer Organismen nutzen können, was darauf hindeutet, dass auxotrophe Stämme von Stoffwechselnebenprodukten über Vitamine hinaus profitieren.

Coenzyme sind für den Zellstoffwechsel unerlässlich. Sie bilden den Kern vieler enzymkatalysierter Reaktionen (z. B. Redoxreaktionen, Transaminierungen und Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen) und fungieren als Träger für Ein-Kohlenstoff-Einheiten und organische Säuren [1]. Organismen mit Defekten in ihrer Biosynthese, Auxotrophe, müssen Coenzyme oder Coenzym-Vorläufermoleküle, also Vitamine, durch externe Zufuhr erhalten. Da sie für ihr Wachstum auf die Versorgung mit Vitaminen in ihrer Umgebung angewiesen sind, würde eine Coenzym-Instabilität den Bedarf an externer Versorgung erhöhen. Kürzlich wurde gezeigt, dass das Kohlenstoffrückgrat von Coenzymen in vivo stabil ist [2]. Tatsächlich ist die Langlebigkeit von Coenzymen, dh das Fehlen eines intrazellulären Abbaus und Wiederaufbaus, eine inhärente Eigenschaft, die möglicherweise evolutionär ausgewählt wurde [2, 3] und als Voraussetzung für die Proliferation auxotropher Organismen angesehen werden kann. Auxotrophe Anforderungen können sich in Laborevolutionsexperimenten in nährstoffreichen Medien schnell entwickeln, wie in Escherichia coli-Populationen gezeigt wurde [4]. Auxotrophe Stämme wurden auch in der Natur isoliert und sind häufig das Ergebnis eines Genverlusts [5,6,7]. Derzeit ist jedoch unklar, wie häufig Auxotrophien bei Bakterien in den meisten Umgebungen vorkommen. In einer Reihe neuerer Studien wurden Vorhersagen zum Ernährungsbedarf direkt aus Genomdaten gemacht, wobei entweder Stoffwechselmodelle im Genommaßstab zum Einsatz kamen oder Lücken im Genom ohne experimentelle Validierung identifiziert wurden [8,9,10,11,12,13] oder die experimentelle Validierung auf wenige wenige konzentriert wurde Stämme [14,15,16]. Diese Studien wurden verwendet, um Interaktionsnetzwerke mikrobieller Gemeinschaften vorherzusagen, die wiederum dazu dienten, auf eine metabolische Kreuzernährung in Bakteriengemeinschaften zu schließen [17]. Die Häufigkeit von Auxotrophien für Coenzyme, Nukleobasen und Aminosäuren in sequenzierten Bakterien wurde in Computeranalysen geschätzt und könnte bis zu 75 % betragen [13], obwohl diese Analysen im Vergleich zu experimentell erhaltenen Daten wahrscheinlich eine hohe Falsch-Positiv-Rate aufweisen [ 18].

Auxotrophe benötigen eine externe Zufuhr von Vitaminen, was die Frage nach physiologischen oder anderen Anpassungen von Auxotrophen, einschließlich der Vitaminspeicherung, aufwirft. Es ist seit langem bekannt, dass auxotrophe Milchsäurebakterien nach dem Entzug von Vitaminen ihr Wachstum aufrechterhalten [19]. Obwohl die intrazelluläre Speicherung elementarer Verbindungen wie Kohlenstoff, Phosphor und Stickstoff nachgewiesen wurde [20,21,22], ist die Speicherung kleiner Moleküle – einschließlich Vitaminen und Coenzymen – derzeit nicht gut etabliert. Es ist auch nicht klar, wie weit verbreitet die potenzielle Speicherung in Umweltbakterien ist. Aufgrund der ökologischen Auswirkungen der Fähigkeit von Mikroben, ihr Wachstum ohne externen Zugriff auf Ressourcen aufrechtzuerhalten, besteht ein erneutes Interesse an der Bewertung der Speicherung verschiedener Verbindungen [23]. Prototrophe E. coli-Stämme, die in Genen mutiert wurden, die an der Biosynthese von Coenzymen beteiligt sind, also „künstliche“ auxotrophe Mutanten, haben nach Entfernung des essentiellen Vitamins eine Speicherkapazität von nur etwa einer Verdoppelung [2]. Dieser zweifach überschüssige Pool an Coenzymen ist wahrscheinlich die Mindestanforderung, um den Stoffwechsel während der Zellteilung robust gegenüber der Zellexpansion zu halten. Diese Ergebnisse führten uns zu der Hypothese, dass sich für Auxotrophe, die in der Natur vorkommen, wo die Coenzym-Versorgung möglicherweise unregelmäßig ist, unterschiedliche Strategien entwickelt haben, um mit der Nährstoffabhängigkeit und der Coenzym-Speicherung umzugehen. Der Verlust der Biosynthese einer Verbindung könnte die Funktion einer Zelle auch auf systemischere Weise beeinträchtigen. Direkte physiologische Konsequenzen, die sich aus dem Verlust der Biosynthese ergeben, wurden an Modellorganismen wie E. coli, Bacillus subtilis und Acinetobacter baylyi untersucht und umfassen Fitnessvorteile (4, 13, 24) und das Potenzial für Kreuzfütterung (25, 26). Diese Studien zeigen, dass Auxotrophe den Wildtyp übertreffen, solange der benötigte Nährstoff verfügbar ist. Es kann davon ausgegangen werden, dass bei ausreichender Evolutionszeit andere Merkmale ausgewählt werden könnten, um den Verlust einer Biosynthesefähigkeit auszugleichen. Dieser Verlust einer wesentlichen Funktion, z. B. eines bestimmten Biosynthesewegs, kann sich dann auf andere Verbindungen erstrecken, die in der jetzt obligatorischen Nische verfügbar sind, sowie auf Funktionen, die bei der Bewältigung von Nährstoffknappheit helfen. Letzteres könnte beispielsweise darin bestehen, den Einsatz auxotropher Coenzyme in Stoffwechselwegen zu optimieren, die Vitaminspeicherung zu erhöhen, mehr Energie in Reparatursysteme zu investieren oder das Wachstum und die Nährstoffaufnahmeraten zu optimieren [9, 27, 28, 29].

Hier untersuchen wir zunächst das Vorkommen von Auxotrophien in der At-LSPHERE-Sammlung, die aus 224 Stämmen besteht, die aus Blättern von in der Natur wachsenden Arabidopsis thaliana-Pflanzen isoliert wurden (30). Die Stämme wurden auf einem mit Vitaminen und Aminosäuren angereicherten Medium isoliert, was systematische Nährstoff-Dropout-Experimente zur Untersuchung von Auxotrophien innerhalb der Stammsammlung ermöglicht. Anschließend befassen wir uns mit der Frage, ob auxotrophe Stämme eine höhere Coenzymspeicherung aufrechterhalten als prototrophe Stämme, und erforschen genomische Merkmale, die gleichzeitig mit Auxotrophie auftreten (und sich möglicherweise gemeinsam entwickeln). Abschließend untersuchen wir den Vitaminerwerb sowie die auxotrophe Fitness in Co-Kultur-Experimenten.

Um auxotrophe Stämme für diese Studie zu identifizieren, haben wir eine repräsentative Stammsammlung mit 224 Mitgliedern (At-LSPHERE) gescreent [30]. Kurz gesagt, drei Exemplare jedes Stamms wurden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, die mit flüssigem Medium gefüllt waren, das mit Vitaminen oder Aminosäuren, mit beiden Arten von Verbindungen oder ohne Zusätze ergänzt war. Als Messwert für das Wachstum wurden Messungen der optischen Dichte (OD600) mit hohem Durchsatz verwendet. Wir fanden heraus, dass von den 156 Stämmen, die in dem Medium wuchsen, 50 % (78) Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum benötigten und daher wahrscheinlich auxotrophe waren (ergänzende Abbildung 1). Auxotrophie kam besonders häufig bei Actinobakterien und Alphaproteobakterien vor, von denen mehr als die Hälfte der getesteten Stämme auxotrophe waren. Aus diesen 78 Stämmen wählten wir 50 mutmaßliche Auxotrophe zur weiteren Charakterisierung in einzelnen Drop-out-Medien aus und stellten fest, dass die meisten Vitamin-Auxotrophen Biotin, Thiamin, Niacin und Pantothenat betrafen, für die wir jeweils 10 oder mehr Auxotrophe fanden (Abb. 1a; Ergänzung). Abb. 1).

a Gleichzeitig auftretende Vitamin-Auxotrophen, abgeleitet aus mangelndem Wachstum ohne ein bestimmtes Vitamin in einem Screening auf Drop-Out-Medien für 50 Stämme. Niacin, Pantothenat, Biotin und Thiamin waren die am häufigsten benötigten Vitamine. Die Kantendicke entspricht der Anzahl der Stämme, in denen die beiden mutmaßlichen Auxotrophien gleichzeitig auftreten. PABA = para-Aminobenzoesäure. (Quellendaten in Quelldaten 1.) b Repräsentative dynamische Experimente zum Vitaminabbau. Das Wachstum wird als Verdoppelung im Zeitverlauf dargestellt. Bei t = 0 erfolgte ein Wechsel von der mit allen vier Vitaminen ergänzten Vorkultur zu einem Medium mit Vitaminmangel (farbige Linien) oder, als Kontrolle, zu einem ergänzten Medium (schwarze Linie). Wenn ein Stamm für ein bestimmtes Vitamin auxotroph war, verlor er dieses Vitamin nach einiger Zeit und hörte auf zu wachsen; Beispielsweise wurde festgestellt, dass Aureiomonas Leaf324 für alle vier Vitamine auxotroph ist. Der Zeitpunkt, zu dem Vitamin-abgereicherte und ergänzte Kulturen abwichen, wird im Liniendiagramm für alle drei Replikate separat visualisiert (Einzelheiten finden Sie unter Materialien und Methoden). (Quellendaten in Quellendaten 2.) c Auxotrophie-Heatmap. Helle Farbe bezieht sich auf Verbindungen, ohne die das Wachstum einer Sorte von der ergänzten Kontrolle abweicht und die Sorte daher auxotroph ist. Bei Aureiomonas Leaf324 beispielsweise sind alle vier Depletionsspalten hellgrau, da das Wachstum ohne jede einzelne Verbindung aufgehört hat. (Quellendaten in Quellendaten 3.) d Coenzymspeicherung in auxotrophen Stämmen (Interquartilbereich und Median). Die Anzahl der Verdoppelungen bei Fehlen des angegebenen Vitamins entspricht der Speicherkapazität. (Quellendaten in Quelldaten 3).

Quelldaten 1Quelldaten 2Quelldaten 3Quelldaten 3.

Obwohl es nützlich ist, den Nährstoffbedarf vieler Stämme parallel zu charakterisieren, ist die Anwendung eines Screens zur Aufklärung des Nährstoffbedarfs einzelner Stämme aufgrund des linearen Bereichs der Plattenlesegeräte begrenzt, was zu falschen Vorhersagen führen könnte. Um diese Einschränkung zu überwinden und zur weiteren Analyse, haben wir 22 Stämme aus verschiedenen Phyla ausgewählt, die beim Wachstum in flüssigen Medien keine Aggregate bildeten, was wir visuell und durch die Bestätigung, dass ihre Anzahl koloniebildender Einheiten im erwarteten Bereich lag (Größenordnung 1e9), sicherstellten /ml) (Ergänzungstabelle 1; siehe ausgewählte Stämme in Ergänzungstabelle 2). Wir kultivierten jeden Stamm in halbkontinuierlichen Batch-Kulturen und überwachten die OD600 in 10-Minuten-Intervallen, wobei wir jede Vertiefung nach jeweils zwei Verdoppelungen mit frischem Medium verdünnten, um ein kontinuierliches exponentielles Wachstum sicherzustellen. Wir verwendeten diese Daten, um das Wachstum jedes der Stämme auf Glukose-Minimalmedium, ergänzt mit Biotin, Niacin, Thiamin und Pantothenat, zu untersuchen und beobachteten, dass alle Stämme in Gegenwart dieser vier Vitamine wuchsen (schwarze Trajektorien in Abb. 1b und ergänzende Abb . 2). Anschließend führten wir Wachstumsexperimente durch, indem wir die Zellen auf vitaminfreie Medien umstellten (siehe Methoden) und so die Zellen einem Vitaminmangel aussetzten. Wir klassifizierten einen bestimmten Stamm als auxotroph, wenn sein Wachstum in einem Vitamin-Drop-out-Medium von den ergänzten Kontrollkulturen abwich (Streudiagramm-Überlagerung in Abb. 1b und ergänzende Abb. 2). Dadurch wurde bestätigt, dass alle 22 Stämme in diesem Experiment Auxotrophe waren (Abb. 1c). Konkret war jeder Stamm im Durchschnitt für zwei Vitamine auxotroph, und 80 % der Stämme waren für mehrere Vitamine auxotroph.

Im Inneren der Zellen werden Vitamine zu Coenzymen verarbeitet. Coenzyme sind katalytisch hochreaktiv und dennoch stabil [2]. Da sie bei Stoffwechselreaktionen nicht verbraucht werden und nur synthetisiert werden, um die Verdünnung durch Wachstum auszugleichen, sind Coenzyme oder ihre Vorläufer möglicherweise in Zellen speicherbar. Um das Potenzial für die intrazelluläre Vitaminspeicherung in den ausgewählten auxotrophen Stämmen zu beurteilen, haben wir die Daten zum halbkontinuierlichen Wachstum verwendet, um die Gesamtzahl der Verdoppelungen zu berechnen, die jeder Stamm nach Vitaminmangel erreichte, bevor er vom exponentiellen Wachstum abwich, wie durch Vergleich mit ergänzten Kontrollkulturen bestimmt (Abb . 1b; Ergänzende Abb. 2). Diese Werte können somit als Indikatoren für die Vitaminspeicherung dienen. Wir fanden heraus, dass die meisten Stämme über einen Vitaminspeicher verfügten, der ein bis zwei Verdoppelungen ermöglichte, was dem von E. coli-Mutanten ähnelte [2]. Wir beobachteten jedoch auch, dass einige auxotrophe Stämme über einen längeren Zeitraum nach der Entfernung von Biotin ein exponentielles Wachstum aufrechterhielten, was einer 4–5-fachen Verdoppelung der Biotinreserven (16–32-facher Überschusspool) entspricht. Ein Stamm, Chryseobacterium Leaf201, verfügte über ein Reservoir, das nach dem Vitaminentzug 9 Verdoppelungen (512-facher Überschuss) ermöglichte (Abb. 1d). Wir haben auch für Rhizobium Leaf68 beispielhaft bestätigt, dass der Wachstumsstillstand mit der intrazellulären Erschöpfung des Coenzyms zusammenfällt (ergänzende Abbildung 3).

Nachdem wir den Vitaminbedarf für 22 validierte Stämme kannten, machten wir uns als nächstes daran, die potenzielle genetische Grundlage für die beobachteten Auxotrophien zu identifizieren, indem wir die Vitamin-Biosynthesewege mithilfe der COG-Annotation (Cluster of Orthologous Groups of Proteins) analysierten. Als prototrophe Kontrollen untersuchten wir weitere 13 Stämme, von denen wir bestätigten, dass sie auf Minimalmedium ohne Zusätze wachsen (ergänzende Abbildung 4). Zunächst fragten wir, ob wir die beobachtete Auxotrophie allein anhand der Genomdaten hätten vorhersagen können. Im Anschluss an frühere Berichte, in denen der Prozentsatz biosynthetischer Gene, die in einem Weg fehlen, als Marker für Auxotrophie verwendet wurde [12, 13, 14, 15, 31], untersuchten wir den Anteil biosynthetischer COG-Terme, die auf allen vier Coenzym-Synthesewegen vorhanden sind. Allen Stämmen, einschließlich Prototrophen, fehlten viele Biosyntheseschritte in den Stoffwechselwegen für alle vier untersuchten Coenzyme (Biotin, Thiamin, Coenzym A, NAD), und wir konnten bei Auxotrophen nicht systematisch weniger Stoffwechselschritte beobachten (Abb. 2). Wir fragten dann, ob der Rückschluss auf Auxotrophien aus dem Vorhandensein/Fehlen einzelner Gene zu einer verbesserten Vorhersage experimentell validierter Auxotrophien führen würde. Zu diesem Zweck verglichen wir mithilfe eines Chi-Quadrat-Tests die Häufigkeit, mit der jeder COG-Term eines Vitaminbiosynthesewegs für die auxotrophe und die prototrophe Gruppe vorhanden war. Auf diese Weise identifizierten wir 1–3 fehlende Gene, die ausreichten, um jede Auxotrophie zu erklären (Tabelle 1). Weitere Einzelheiten zur Art der spezifischen Reaktionen finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.

ein Bruchteil der COG-Terme jedes Coenzym-Biosynthesewegs (Zeilen), der in jedem Stamm vorhanden ist (Spalten); Stämme sind nach Stamm farblich gekennzeichnet und nach dem Prozentsatz des vorhandenen Signalwegs gruppiert. Schwarze Rechtecke zeigen an, dass sich der entsprechende Stamm in dieser Studie als auxotroph für das Coenzym erwies (Abb. 1).

Nachdem wir 1–3 Gene identifiziert hatten, die wahrscheinlich für jede beobachtete Auxotrophie verantwortlich sind, untersuchten wir, ob die Ergebnisse auch für die verbleibenden auxotrophen Stämme in der At-LSPHERE-Stammsammlung gelten (ergänzende Abbildungen 1c und 1a). Um dies zu erreichen, wollten wir robuste Klassifikatoren für jeden der vier beobachteten auxotrophen Anforderungen erstellen. Wir haben zunächst eine Stichprobe von 63 auxotrophen Stämmen erstellt, von denen 35 oben validiert wurden, und für weitere 28 Stämme, für die Vorhersagen aus der ergänzenden Abbildung 1c als Zielvariable verwendet wurden. Zweitens haben wir einen Entscheidungsbaumklassifikator trainiert, der entweder auf den 1–3 in der Chi-Quadrat-Analyse ausgewählten Merkmalen (Tabelle 1) oder auf gleich vielen zufällig ausgewählten Merkmalen basiert. Diese Modelle erreichten Leistungskennzahlen von 80–100 % (ergänzende Abbildung 5). Wir haben die Modelle verwendet, um die Auxotrophie für 139 Stämme aus der At-LSPHERE-Sammlung vorherzusagen, bei denen im ergänzten Medium Wachstum beobachtet wurde (und die daher physiologisch vergleichbar sind) und für die COG-Anmerkungen verfügbar waren (Ergänzungstabelle 3). Wir haben diese Merkmale auch genutzt, um die Auxotrophie auf taxonomischer Ebene erneut zu untersuchen. Die COG-Begriffe, die wir in der Analyse als nicht vorhanden identifizierten, reproduzierten die geschätzte phylogenetische Anreicherung der Auxotrophie bei Actinobakterien und Alphaproteobakterien, die eng mit Rhizobium spp. verwandt sind. (Ergänzende Abbildung 6; vergleiche mit ergänzende Abbildung 1).

Genomreduktion wurde bereits bei auxotrophen Umweltbakterien beschrieben [32]. Wir befassten uns daher mit der Genomreduktion und möglichen damit einhergehenden Genverlustereignissen für die 139 Stämme, für die Auxotrophievorhersagen auf der Grundlage funktioneller genomischer Annotation und beobachtetem Wachstum in einem definierten Medium möglich waren (ergänzende Abbildung 6). Tatsächlich fanden wir bei Auxotrophen im Vergleich zu Prototrophen deutlich kleinere Genome (Abb. 3a). Dieser Effekt war jedoch klassen-/stammabhängig: Die Genomreduktion war bei Actinobakterien signifikant (19 % kleinere Genome), wobei ein hoher Anteil (> 50 %) der Stämme Auxotrophe sind (ergänzende Abbildung 1b). Da es in den analysierten Stämmen nur sechs Firmicutes-Arten gibt, ist es schwierig, allgemeine Schlussfolgerungen zu ziehen. Die vier Auxotrophen weisen jedoch ein Genom auf, das nur halb so groß war wie die beiden prototrophen Stämme und weisen auch weniger offene Leserahmen auf (ergänzende Abbildung 7). Die hier identifizierten auxotrophen Stämme benötigten durchschnittlich zwei Aminosäuren und zwei Vitamine (Abb. 1, ergänzende Abb. 1). Daher würde der beobachtete Verlust biosynthetischer Gene für 0,25 % kleinere Genome in Auxotrophen verantwortlich sein (für ein Bakterium, das durchschnittlich 5.000 Gene kodiert; Schätzung basierend auf Abb. 3a). Unsere Beobachtung, dass Auxotrophe kleinere Genome haben, wirft daher die Frage auf, ob es andere mit der Auxotrophie verbundene biologische Prozesse oder Wege gibt, die die Genomreduktion erklären.

Aus RefSeq erhaltene Genome mit den Zugangsnummern in Quelldaten 5. In allen Panels waren 139 Stämme enthalten, die in Flüssigkulturen wuchsen (ergänzende Abbildung 1) und für die COG-Anmerkungen verfügbar waren. Der Auxotrophiestatus wurde mithilfe der Modelle in Abb. 2 und Tabelle 1 vorhergesagt. a Genomgrößen zwischen Auxotrophen und Prototrophen. b Anzahl der Reaktionen, die jedes von Vitaminen abgeleitete Coenzym erfordern (x-Achse) in Stämmen, die für jedes Coenzym auxotroph bzw. prototroph sind (in separaten Diagrammen). Das erste Diagramm oben links zeigt beispielsweise einen Vergleich des Coenzymverbrauchs von 6 Coenzymen zwischen Biotin-Auxotrophen und Prototrophen. Stoffwechselmodelle wurden durch Ausführen von CarveMe [33] auf den RefSeq-Zugangsnummern erhalten. c Wege, auf denen >20 % der Gene für jedes Vitamin unterschiedlich zwischen Auxotrophen und Prototrophen vorhanden waren. „Unterrepräsentiert“ bezieht sich hier auf eine geringere Anzahl an Auxotrophen.

Quelldaten 5.

Eine denkbare genomische Anpassung, die Auxotrophie mit Genomreduktion verbinden würde, besteht darin, dass sich auxotrophe Stämme so entwickelt haben, dass sie weniger abhängig von Coenzymen sind, die sie nicht synthetisieren können. Allerdings ist auch das umgekehrte Szenario plausibel: Wenn das Vitamin in der Umwelt frei verfügbar ist, könnte ein positiver Selektionsdruck entstehen, Coenzyme gegenüber kostenlosen Vitaminen zu bevorzugen. Um zu untersuchen, ob eine Korrelation (positiv oder negativ) zwischen der Auxotrophie für ein bestimmtes Coenzym und der Verwendung desselben in Bezug auf die Anzahl der Enzyme besteht, haben wir Stoffwechselmodelle im Genommaßstab für alle einzelnen Stämme (GEM) erstellt (33). Insgesamt war die Anzahl der Reaktionen in Stoffwechselmodellen in beiden Gruppen ähnlich (ergänzende Abbildung 7), was darauf hindeutet, dass Auxotrophe keine stromlinienförmigen Stoffwechselnetzwerke haben. Wir wollten untersuchen, ob auxotrophe Stämme in ihren enzymatischen Reaktionen bevorzugt ein Coenzym gegenüber dem anderen verwenden. Insbesondere können Niacin-Auxotrophe möglicherweise FAD- oder FMN-abhängige Enzyme anstelle von NAD(P)-abhängigen Enzymen verwenden. Mithilfe von GEMs haben wir die Anzahl der Enzyme berechnet, die jedes Coenzym sowohl für Auxotrophe als auch für Prototrophe benötigen, um den Grad der Abhängigkeit eines Stamms vom entsprechenden Vitamin zu messen. Obwohl GEMs keine Informationen über die Expressionsniveaus der einzelnen fraglichen Enzyme (und damit über potenzielle unterschiedliche Anforderungen des Enzyms) enthalten, bieten ihre stöchiometrischen Einschränkungen und ihre Netzwerkstruktur eine größere Sicherheit für die Genexpression als die Genomanalyse allein. Wir fanden heraus, dass Auxotrophe und Prototrophe bei den meisten Coenzymen die gleiche Anzahl an Reaktionen aufwiesen (Abb. 3b). Niacin-Auxotrophe hatten 10 % mehr Enzyme bei Verwendung von NAD(H) und 20 % weniger Enzyme bei Verwendung von FAD(H) (p-Wert <0,05, χ2-Test), was auf eine Präferenz für die Verwendung des Coenzyms hinweist, für das die Biosynthese verloren geht. Für Biotin hatten auxotrophe Stämme 15 % mehr Biotin-abhängige Enzyme (p-Wert <0,05, χ2-Test). Insgesamt zeigt diese Analyse, dass die bei auxotrophen Stämmen beobachtete Genomreduktion nicht systematisch durch weniger Enzyme erklärt werden kann, die das jeweilige Coenzym benötigen. Daher ist die Stoffwechselkapazität bei Auxotrophen möglicherweise nicht verringert, und Auxotrophe haben ihre Stoffwechselreaktionen möglicherweise auf die Verwendung der essentiellen Vitamine zurückgeführt.

Abgesehen von den direkten Auswirkungen auf die Verwendung von Coenzymen kamen wir zu dem Schluss, dass auxotrophe Stämme möglicherweise andere Merkmale entwickelt haben, die indirekt mit der Verwendung von Coenzymen zusammenhängen, entweder bevor oder nachdem sie auxotrophe wurden. Solche Merkmale könnten zum Verlust von Funktionsereignissen in anderen Biosynthesewegen sowie zum Verlust von Genen führen, die in der begrenzten Nische nicht essentiell sind, beispielsweise bei der Nutzung einer Kohlenstoffquelle. Wir haben daher versucht, die metabolische Umverteilung allgemeiner anzugehen. Um Gene zu finden, deren Vorhandensein mit Auxotrophie korreliert, führten wir eine genomweite funktionelle Genomanalyse durch. Wir untersuchten zunächst, ob jeder COG-Begriff bei Auxotrophen und Prototrophen unterschiedlich häufig vorkam, und ordneten dann die signifikant unterschiedlichen COG-Begriffe Pfaden zu. Die Signifikanz wurde durch den χ2-Test bestimmt und eine mehrfache Testkorrektur wurde mit FDR durchgeführt. Auf diese Weise identifizierten wir eine Reihe konservierter Unterschiede zwischen Auxotrophen und Prototrophen (Abb. 3c, Ergänzungstabelle 4). Insgesamt wurde das Muster durch Funktionsverlust bei Auxotrophen dominiert. Indem wir den Grenzwert für unterschiedlich häufig vorkommende COG-Terme auf 20 % aller Pathway-Gene festlegten, ermittelten wir den Biosyntheseweg für jede bekannte Auxotrophie, was bestätigte, dass dieser Ansatz biologisch bedeutsame Unterschiede zwischen den Gruppen erfassen kann. Andere Genausfälle führten zum Verlust der enzymatischen Funktion im Energiebereich, insbesondere des Glukosestoffwechsels sowie anderer Biosynthesewege wie Aminosäuren und anderer Coenzyme, die über die hier getesteten hinausgingen, wohingegen Salvage-Systeme in der auxotrophen Gruppe häufiger vorkamen.

Co-Kulturexperimente können genutzt werden, um Einblicke in bakterielle Interaktionen in mikrobiellen Gemeinschaften zu gewinnen [34,35,36,37]. Hier haben wir gefragt, ob Auxotrophen Zugang zu Vitaminen von kokultivierten Prototrophen haben. Zu diesem Zweck haben wir phylogenetisch repräsentative Vitamin-auxotrophe (n = 10) und prototrophe (n = 10) Stämme für ein Co-Kultur-Experiment ausgewählt (Abb. 4a). Wir führten ein serielles Verdünnungsexperiment der Stammmischung (jeweils 3 biologische Replikate in 3 technischen Replikaten) in Minimalmedium, ergänzt mit 20 mM Glucose und allen 20 proteinogenen Aminosäuren (jeweils 100 μM), durch. Die Medien unterschieden sich lediglich darin, ob sie mit Vitaminen ergänzt waren. (Abb. 4b, c). Die Kulturen wurden in regelmäßigen Abständen mittels 16S-rRNA-Gensequenzierung analysiert, um die relative Zusammensetzung der Bakterienspezies zu bestimmen. Das Wachstum war unter beiden Bedingungen vergleichbar (Abb. 4c). Wir beobachteten, dass das relative Häufigkeitsprofil zwischen den Medien in beiden Gruppen, dh Auxotrophen und Prototrophen, ähnlich war und unabhängig davon, ob Vitamine ergänzt wurden oder nicht (Abb. 4d, graue vs. orangefarbene Säulen für jeden Stamm; ergänzende Abb. 8). Die einzige auxotrophe Spezies, die von ergänzten Vitaminen profitierte, war Pedobacter Leaf132 (p-Wert 0,003, rm-ANOVA). Zwei auxotrophe Stämme, Rhizobium Leaf202 und Arthrobacter Leaf137, wiesen höhere relative Häufigkeiten in Kulturen auf, in denen keine Vitamine ergänzt wurden (p-Werte <0,01 rm-ANOVA). Diese Analyse zeigt somit, dass ein Mangel an externer Vitaminergänzung das Wachstum von Auxotrophen nicht verhindert, wenn sie in einer Gemeinschaft mit prototrophen Stämmen kultiviert werden, und deutet auf eine Vitaminkreuzfütterung hin.

eine Auswahl an Stämmen für Co-Kulturen. Insgesamt wurden 20 Stämme ausgewählt, um die phylogenetische Vielfalt in der Blattmikrobiota von A. thaliana darzustellen. Das Clustering basiert auf 16S-rRNA-Gensequenzen voller Länge. b Die in Tafel A gezeigten Stämme wurden in gleichen Mengen (Einzelheiten siehe Methoden) in drei biologischen Inokula gemischt. Jedes Inokulum wurde verwendet, um drei technische Replikate unter zwei Wachstumsregimen zu beimpfen: Minimalmedium mit und ohne Vitamine, was 18 Kulturen ergab. Alle 20 proteinogenen Aminosäuren wurden allen Kulturen zugesetzt (100 µM). c Wachstumsmessungen der Kulturen aus b Die Kulturen wurden insgesamt 120 Stunden lang gezüchtet und nach 24, 48 und 72 Stunden verdünnt. Nach 9, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden (angegeben als Punkte) wurden Proben für die 16S-rRNA-Gensequenzierung (Zellen) und LC/MS (Überstände) entnommen. d Relative Häufigkeit aller 20 Stämme (Spalten) im Co-Kultur-Experiment. Für jeden Stamm wird der Durchschnitt der drei technischen Replikate für jedes biologische Replikat als Änderung der relativen Häufigkeit im Vergleich zum vorherigen Zeitpunkt angezeigt, zunächst im Minimalmedium mit Vitaminen (Spalten mit orangefarbenen Kästchen gekennzeichnet), dann im Minimalmedium ohne Vitamine (Spalten grau beschriftet). Für jeden Stamm sind die drei Replikate im gleichen Zustand durch dünne weiße Linien und die beiden Bedingungen durch dicke graue Linien getrennt. Die 20 Stämme sind durch dicke schwarze Linien getrennt. Stämme werden nach Phylogenie geclustert, wie aus dem 16S-rRNA-Gen-Alignment berechnet.

Um das Vorhandensein einer Kreuzfütterung zu beurteilen, untersuchten wir die verbrauchten Medien aus den oben genannten Co-Kulturen (Abb. 5). Wir haben die Medien ohne Bakterien (Zeitpunkt 0 Stunden) sowie die Überstände nach 9 und 24 Stunden Kokultur gemessen. Wir verglichen zunächst die Vitaminpools unter den beiden Bedingungen (± Vitamine). Wenn Vitamine ergänzt wurden, sank die Niacin-, Pantothenat- und Thiaminkonzentration zwischen 0 und 9 Stunden und weiter zwischen 9 und 24 Stunden, was auf eine Nettoaufnahme durch die im Medium gezüchteten Bakterien schließen lässt (orangefarbene Reihe in Abb. 5a). Angesichts der Tatsache, dass die Hälfte der inokulierten Stämme für eines oder mehrere davon auxotroph war, war ein Rückgang des Vitaminpools dieser vier Vitamine zu erwarten. Die Biotinkonzentration nahm jedoch während des Experiments nicht ab (orangefarbene Reihe im ersten Feld in Abb. 5a), obwohl fast alle Stämme dafür auxotrophe Tiere waren, was entweder auf geringe Biotinaufnahmeraten durch Auxotrophe hindeutet oder darauf, dass prototrophe Stämme Biotin zu 100 % sezernierten vergleichbare Raten wie die Aufnahme von Biotin durch auxotrophe Stämme. Wir beobachteten auch die Aufnahme von Pyridoxal, bei dem kein Stamm auxotroph war. Die Riboflavinkonzentration lag in den bakterienfreien Medien unter der Nachweisgrenze, sammelte sich jedoch während des Bakterienwachstums kontinuierlich im Medium an, was darauf hindeutet, dass mindestens einer der Stämme in der Co-Kultur mehr Riboflavin absonderte, als andere aufnahmen. Im an Vitaminen erschöpften Medium fanden wir nach 9 Stunden eine Anreicherung von Niacin, Pantothenat und Pyridoxal, gefolgt von einem Rückgang dieser Vitamine nach 24 Stunden, was darauf hindeutet, dass die Bakterien diese Vitamine zunächst in das Medium absonderten und sie anschließend aufnahmen ( Abb. 5a, graue Reihe). Die Thiamin- und Biotin-Pools blieben unter der Nachweisgrenze. Aminosäuren, die in beiden Medien ergänzt wurden (neben Glucose als einzige Hauptkohlenstoffquelle), nahmen in allen Co-Kulturen im Vergleich zu den reinen Medien ab, was auf eine Nettoaufnahme aus dem Medium hinweist (Abb. 5b). Der Großteil des bereitgestellten Glutamats (eine attraktive Kohlenstoff- und Stickstoffquelle [38]) war nach 9 Stunden Co-Kultur noch verfügbar und wurde hauptsächlich während der stationären Phase verbraucht.

a Zeitreihe des Vitaminverbrauchs in Co-Kulturen, gemessen an den Überständen der Co-Kulturen. Für jedes Vitamin wird der log10-Wert der normalisierten Peakfläche des Gesamtionenstroms zuerst für Kulturen mit Vitaminzusatz und dann für Kulturen mit Vitaminmangel angezeigt. b Aminosäuren, gemessen aus den Überständen der Co-Kultur. Bei den Daten handelt es sich um log10-transformierte Peakflächen, normalisiert auf das Signal des Mediums, das in beiden Medien mit Aminosäuren (+ und – Vitamine) ergänzt wurde. Jede Zelle in der Heatmap stellt den Durchschnitt von 9 Replikaten dar.

Auxotrophe Mutanten haben in paarweisen Konkurrenzexperimenten häufig einen Fitnessvorteil gegenüber prototrophen Vorfahrenstämmen [13, 24, 39]. In der folgenden Analyse haben wir beurteilt, ob dies auch im Gemeinschaftskontext natürlicher Auxotrophen und Prototrophen zutrifft. Insbesondere haben wir den Artenreichtum anhand der Wachstumsrate und des Ertrags jedes Stamms in einzelnen Kulturen vorhergesagt und diese Vorhersagen mit experimentell gewonnenen Daten verglichen (Abb. 4). Wir haben die Analyse der relativen Häufigkeitsdaten in mit Vitaminen angereichertem Minimalmedium (orangefarbene Säulen in Abb. 4d) durchgeführt, indem wir den Artenreichtum (Anzahl der erkannten Arten dividiert durch die Anzahl der ursprünglich in die Co-Kultur eingeführten Arten) im Zeitverlauf verglichen haben zwei Gruppen: Auxotrophe und Prototrophe. Wir fanden heraus, dass zwei Drittel der Stämme unentdeckt blieben und daher nach den ersten beiden Verdünnungszyklen (nach 24 Stunden und 48 Stunden) als verloren interpretiert wurden, bevor sie sich schließlich nach 72 Stunden stabilisierten (Abb. 6a). In der prototrophen Gruppe gingen mehr Stämme verloren: Drei Viertel der Prototrophen blieben nach 48 Stunden unentdeckt, deutlich weniger als Auxotrophe, wobei nur die Hälfte unentdeckt blieb (p ≪ 0,001, rm-ANOVA, Abb. 6a). Um zu untersuchen, ob das statistisch unterschiedliche Ergebnis zwischen Auxotrophen und Prototrophen zu erwarten war, haben wir versucht, den Artenreichtum anhand des Wachstums in Monokulturen vorherzusagen. Zu diesem Zweck wurden Wachstumsparameter experimentell in demselben mit Vitaminen angereicherten Medium bestimmt, das für die Co-Kultur-Experimente verwendet wurde (Abb. 6b). Anhand dieser Daten parametrisierten wir ein Verbraucher-Ressourcen-Modell und simulierten die erwartete Häufigkeit jedes Stammes in den mit Vitaminen angereicherten Co-Kulturen. Kurz gesagt wurde die Glukosekonzentration iterativ aktualisiert, um eine eventuelle Kohlenstoffbegrenzung in einer Batch-Kultur zu simulieren, die Wachstumsraten wurden gemäß der Monod-Kinetik aktualisiert und es wurden keine Wechselwirkungen zwischen Arten berücksichtigt (Details zur Modellierung finden Sie unter „Methoden“). Aus den simulierten Häufigkeiten haben wir den theoretischen Artenreichtum berechnet. Wir fanden heraus, dass die Simulation in der prototrophen Gruppe den experimentell beobachteten Artenreichtum qualitativ erfasste (hellblaue Linie im Vergleich zur dunkelblauen Linie in Abb. 6c) und den endgültigen Artenreichtum korrekt vorhersagte. Alle auxotrophen Arten gingen in der Simulation verloren (hellrote Linie im Vergleich zur dunkelroten Linie in Abb. 6c), was aufgrund ihrer geringeren Wachstumsraten und Erträge im Vergleich zu den prototrophen Stämmen zu erwarten war (Abb. 6b).

a Artenreichtum in Co-Kulturen, die in mit Vitaminen angereichertem Medium kultiviert werden. Quelldaten in Quelldaten 6. b Experimentell ermittelte Wachstumsraten und Erträge (=Tragfähigkeit) für jeden Stamm, der im mit Vitaminen angereicherten Medium wächst. Quelldaten für Wachstumsraten in Quelldaten 9 und für Erträge in Quelldaten 10. c–f Artenreichtum, modelliert durch Verbraucherressourcenmodelle. Fehlerbalken für die Modelle wurden über Sensitivitätsanalysen wie folgt ermittelt. In c und d wurde der Schwellenwert, ab dem ein Bakterium als „vorhanden“ gilt, zwischen 0,1 % und 1 % der Gesamthäufigkeit variiert. In e wurde der Schwellenwert der Wachstumsrate für Bakterien, die die zweite Kohlenstoffquelle absondern sollten, zwischen 0,3 h−1 (n = 15) und 0,6 h−1 (n = 3) variiert. In f variierte die Wirksamkeit der Auxotrophen, bevorzugt die zweite Kohlenstoffquelle zu nutzen, um das Zwei- bis Fünffache der Wirksamkeit der Prototrophen. Quelldaten in Quelldaten 6.

Quelldaten 6Quelldaten 9Quelldaten 10.

Der offensichtliche Widerspruch zwischen dem Konsumenten-Ressourcen-Modell und den experimentellen Daten veranlasste uns zu untersuchen, ob eine Erweiterung der Modelle den beobachteten Artenreichtum erfassen könnte. Wir begannen mit der Einführung eines Vitamin-Cross-Feeding-Begriffs, der im ursprünglichen Modell nicht enthalten war. Aus den Exometabolomics-Messungen (Abb. 5) erfuhren wir, dass Prototrophen Vitamine in das Medium absondern und dadurch dessen Vitaminkonzentration zumindest vorübergehend erhöhen. Darüber hinaus zeigte die 16S-rRNA-Gensequenzierung von Proben aus Kulturen, denen keine Vitamine zugesetzt wurden, dass der beobachtete Anstieg der Vitaminkonzentration während der Co-Kultivierung mit Prototrophen ausreichte, um das Wachstum der Auxotrophen zu unterstützen (Abb. 4). Wenn die Vitaminkonzentration im Wachstumsmedium vor der Kohlenstoffbegrenzung so niedrig geworden wäre, dass das Wachstum begrenzt wäre, hätten diese zusätzlichen Vitamine zu einer Ertragssteigerung führen können. Zu diesem Zweck haben wir Wachstumsdaten in einer Reihe physiologisch relevanter Vitaminkonzentrationen erfasst (ergänzende Abbildung 9). Die beobachteten Unterschiede sowohl bei der Wachstumsrate als auch beim Ertrag waren im Allgemeinen gering. Nichtsdestotrotz haben wir das Wachstum jedes Stamms im Verbraucherressourcenmodell von den Wachstumsparametern jedes Stamms bei 1 µM Vitaminen zu denen beim Anbau in 10 µM Vitaminen geändert und so den möglichen frühen Wachstumsstopp verringert. Wir beobachteten, dass dieser simulierte Anstieg der Vitaminkonzentration nicht zu einem Anstieg des vorhergesagten Reichtums an auxotrophen Arten führte (Abb. 6d).

Verbraucherressourcenmodelle mit Vitamin-Querfütterung erfassten den experimentell beobachteten Unterschied im Artenreichtum nicht (Abb. 6d). Ein alternatives Szenario für den hohen Reichtum in der auxotrophen Gruppe der Co-Kultur besteht darin, dass sie Stoffwechselnebenprodukte als Kohlenstoffquellen nutzen könnten. Es ist bekannt, dass viele schnell wachsende Bakterien auch unter aeroben Bedingungen ihre Kohlenstoffquelle fermentieren, was zur Sekretion von Nebenprodukten wie Pyruvat, Acetat oder Succinat führt [40, 41]. Daher sind Veränderungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der stationären Phase (zwischen 9 und 24 Stunden sowie zwischen 96 und 120 Stunden) wahrscheinlich auf den (Mit-)Verbrauch von Stoffwechselnebenprodukten zurückzuführen, nachdem die Hauptkohlenstoffquelle Glukose verbraucht wurde. Um dieses Szenario anzugehen, haben wir eine zweite Kohlenstoffquelle in das Modell eingeführt, die die Sekretion einer Verbindung wie Acetat durch schnell wachsende prototrophe Stämme (Abb. 6b) effektiv nachahmt. Anschließend ließen wir alle langsam wachsenden Stämme auf dieser neu verfügbaren Ressource mit Raten wachsen, die proportional zu ihrer Wachstumsrate auf Glukose waren. Da die Auxotrophe in der langsam wachsenden Gruppe angereichert waren, konnten sie das Nebenprodukt bevorzugt nutzen, während der prototrophen Gruppe die gleiche Chance gegeben wurde, auf dem sekretierten Substrat zu wachsen, sofern die Randbedingung des langsamen Wachstums erfüllt war (siehe ergänzende Abbildung). . 10 für Einzelheiten zu Konzentration und Wirkung auf die Gesamtzellzahl). Das Hinzufügen des Kohlenstoff-Querfütterungsterms verbesserte tatsächlich die Vorhersagen im Vergleich zum ursprünglichen Modell; Beide Gruppen verlieren an Artenreichtum, aber keine Gruppe geht vollständig verloren, und der Artenreichtum stabilisiert sich schließlich (Abb. 6e). Dieses Modell sagt jedoch immer noch einen höheren Artenreichtum der prototrophen Gruppe voraus. Wir haben Auxotrophen daher einen bevorzugten Zugang zur neu verfügbaren Kohlenstoffquelle gewährt, indem wir ihre Substrataffinität erhöht haben. In diesem Szenario erfassten die Modelle die experimentell ermittelte qualitative Dynamik (Abb. 6f). Zusammengenommen legt diese Analyse nahe, dass eine erhöhte Fähigkeit zur gegenseitigen Fütterung von Kohlenstoffquellen den Erfolg auxotropher Stämme in Co-Kulturen bestimmt.

Coenzyme sind nicht nur allgegenwärtig, sondern im Allgemeinen in allen Lebensbereichen konserviert. Sie erweitern den katalytischen Werkzeugkasten von Proteinen und fungieren als Trägermoleküle für organische Säuren und Ein-Kohlenstoff-Einheiten [1]. Hier haben wir die auxotrophen Anforderungen von Umweltbakterien charakterisiert, die aus der Phyllosphäre von A. thaliana isoliert wurden, und genomische und physiologische Merkmale untersucht, die mit der Unfähigkeit zur Vitaminsynthese einhergehen. Wir fanden heraus, dass die Vitamin-Auxotrophie bei Biotin, Niacin, Pantothenat und Thiamin häufig vorkommt und dass die Auxotrophie systematisch mit dem Fehlen spezifischer Gene auf den jeweiligen Biosynthesewegen verbunden ist. Obwohl andere Studien über das Fehlen einiger der in dieser Studie identifizierten Gene bei anderen Auxotrophen berichtet haben [7, 8], sind weitere Studien erforderlich, um zu beurteilen, ob Auxotrophie im Allgemeinen durch den Verlust dieser wenigen spezifischen Gene verursacht wird. Darüber hinaus definierten unsere experimentellen und bioinformatischen Analysen eine Reihe auxotropher spezifischer Funktionen sowie die Kreuzfütterung und Speicherung von Coenzymen in verschiedenen natürlich auxotrophen Bakterienisolaten.

Nachdem ein Stamm seinen Biosyntheseweg verloren hat, wird er von einer externen Quelle dieses Nährstoffs abhängig. Daher wird seine Nische auf diejenigen beschränkt sein, die zumindest gelegentlich Zugriff auf diese Ressource haben. Daher verlieren Stammpopulationen möglicherweise die Fähigkeit, alle Verbindungen zu synthetisieren, die die erzwungene Nische bereitstellen kann. Tatsächlich beobachten wir bei vier von fünf bestätigten Auxotrophen mehrere Auxotrophien (Abb. 1). Es wurde bereits gezeigt, dass die gegenseitige Zufuhr von Nährstoffen die Koexistenz fördert [42]. In einem Zwei-Stämme-System konnte ein „günstiger“ Stamm (Mutant mit Syntheseverlust) den „Helfer“-Stamm, der den Nährstoff lieferte, nicht verdrängen. Wenn ein dritter Stamm beteiligt war, der den gleichen Nährstoff liefert, übertraf der Nutznießer den Helferstamm; Somit kann ein ausgetauschter Metabolit möglicherweise nur eine Gemeinschaft bestehend aus zwei Stämmen stabilisieren. In der Natur vorkommende Gemeinschaften können Hunderte oder Tausende von Mitgliedern haben. Daher sind für jeden auxotrophen Stamm mehrere Auxotrophien erforderlich, damit Wechselwirkungen zur Stabilisierung großer Gemeinschaften auftreten können. Da wir bei 80 % der Auxotrophen mehrere Auxotrophien beobachten, können sie durch Kreuzfütterung zur beobachteten Stabilität der Gemeinschaft beitragen [30, 43]. Daher schlagen wir vor, dass die Identität der benötigten Verbindung durch die Nische bestimmt wird, die Anzahl der Auxotrophien pro Stamm jedoch eher eine inhärente Eigenschaft der Gemeinschaft ist. Obwohl weitgehend oligotroph, gibt es auf Blattoberflächen nachweisbare Mengen an Kohlenstoffquellen (Glukose, Methanol, Saccharose, Fruktose) [44], Aminosäuren und sogar Vitaminen, die entweder vom Pflanzenwirt selbst oder von den in der Nische lebenden Bakterien zur Verfügung gestellt werden [6]. , 45, 46]. Auxotrophien für metabolisch teures Vitamin B12 (das nicht im pflanzlichen Stoffwechsel verwendet wird) wurden nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 11).

Die Genome von Bakterienpopulationen verändern sich als Reaktion auf den Selektionsdruck ihrer Umgebung und durch zufällige Effekte, z. B. genetische Drift. Beispielsweise erfordert die Biosynthese verschiedener Verbindungen die Zuweisung zellulärer Ressourcen in Form von Energie (hauptsächlich ATP und Redox-Coenzyme) und Proteinsynthese, also Kosten. Vorausgesetzt, dass das Produkt eines solchen Biosyntheseprozesses in der Umwelt verfügbar ist, vermeiden diejenigen Organismen, die die Fähigkeit zur Biosynthese dieser Verbindung verlieren, die Kosten. In einer Reihe von Studien wurde argumentiert, dass Zellen durch die Vermeidung der Biosynthesekosten einen Fitnessvorteil erlangen, der einen selektiven Vorteil beim Verlust der Biosynthese ermöglicht – diese Theorie wird als Black-Queen-Hypothese bezeichnet [4, 13, 39]. Der Verlust der Biosynthese kann jedoch auch neutral sein und durch genetische Drift verursacht werden. Kleinere Genome werden häufig bei Bakterien beobachtet, die aus reichhaltigen Wachstumsumgebungen isoliert wurden, und stehen in engem Zusammenhang mit endosymbiotischen und parasitären Lebensstilen [32, 47, 48, 49]. Es ist jedoch nicht möglich, auf der Grundlage der beobachteten Genomreduktion auf den Mechanismus zwischen Selektion und genetischer Drift zu schließen.

Eine Genomreduktion kann auf zwei Arten erfolgen: 1. allgemeine Genomreduktion und 2. Verlust spezifischer Gene [42]. In dieser Studie beobachteten wir sowohl das spezifische als auch das allgemeine Fehlen von Genen. Der größte Teil der Genomreduktion fiel jedoch unter die erste Kategorie, da wir bei Auxotrophen bis zu 19 % kleinere Genome beobachteten, wovon weniger als 1 % durch das Fehlen der Gene erklärt werden kann, die in direktem Zusammenhang mit der Auxotrophie stehen (Abb. 2 und 3). . Wir beobachteten auch eine genomische und metabolische Neuverteilung, insbesondere bei Niacin-Auxotrophen (Abb. 3b, c). Unsere Analysen deuten auch darauf hin, dass auxotrophe Bakterien über mehr Enzyme verfügen, die das Vitamin benötigen, für das sie auxotroph sind (insbesondere Biotin und NAD), als prototrophe Bakterien (Abb. 3b). Diese Beobachtung impliziert nicht einen größeren Umsatz oder Bedarf an Coenzym, sondern vielmehr, wie viele Reaktionen durch die Einschränkung des Vitamins gestört werden könnten und welche Auswirkungen diese Vitamineinschränkung daher auf das Stoffwechselnetzwerk hätte. Ob der Bedarf selbst konstant bleibt oder sogar sinkt, hängt davon ab, inwieweit die Gene translatiert werden. Wir gehen davon aus, dass der Grad der Abhängigkeit (hier definiert durch die Anzahl der Enzyme, die das Coenzym verwenden) sich möglicherweise nicht so stark auf Auxotrophe auswirkt wie auf Prototrophe, da Prototrophe aufgrund der Kosten der Vitaminbiosynthese ihre Abhängigkeit vom Coenzym minimieren könnten.

Der Anteil der in einem Stoffwechselweg vorhandenen biosynthetischen Gene wird häufig zur Klassifizierung von Bakterien in Auxotrophe oder Prototrophe herangezogen [10, 13, 16]. Unsere Ergebnisse stimmen mit zuvor veröffentlichten Arbeiten überein (18), was darauf hindeutet, dass die Vorhersage von Auxotrophie basierend auf der Häufigkeit von Genen zu ungenauen Vorhersagen führt. Wir beobachteten auch, dass, obwohl zufällige Lücken in den Genomen im Allgemeinen und in den Coenzym-Biosynthesewegen im Besonderen häufig beobachtet werden, das Fehlen von 1–3 spezifischen Coenzym-Biosynthesegenen pro Weg stark mit der beobachteten Auxotrophie verbunden ist (Abb. 2; Tabelle 1). Der Verlust einiger der hier identifizierten Gene wurde bereits zuvor mit Auxotrophie in Verbindung gebracht [7, 8]. Es bleibt eine offene Frage, ob Auxotrophie allgemein durch den Verlust einiger spezifischer Gene verursacht wird. Die Genauigkeit der Vorhersage von Auxotrophien auf der Grundlage genomischer Daten könnte daher verbessert werden, indem beispielsweise Genen, die bekanntermaßen bei Auxotrophen häufig verloren gehen, ein höheres Gewicht beigemessen wird. In dieser Studie konnten wir Auxotrophie mit 80–100 % Genauigkeit, Erinnerung und Präzision vorhersagen, indem wir Modelle mit den ausgewählten Merkmalen trainierten (Tabelle 1).

Wir beobachteten bei einigen auxotrophen Stämmen eine höhere Robustheit gegenüber Biotin-Limitierung (Abb. 1), was die Frage nach dem Speichermechanismus aufwirft. Bei Säugetieren wurde die Speicherung von Biotin mit der mitochondrialen Acetyl-CoA-Carboxylase in Verbindung gebracht [50]. Bei Biotin-auxotrophen Hefen wurde vermutet, dass die Histon-Biotinylierung als potenzielle Biotin-Speicherung bei auxotrophen Candida albicans dient, im Gegensatz zur Biotin-prototrophen Hefe Saccharomyces cerevisiae, die ihre Histone nicht biotinyliert [51]. Im einfachsten Fall könnte die Speicherung unspezifisch und auf Proteine ​​verteilt sein, die Biotin als prosthetische Gruppe kovalent binden. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gestützt, dass Biotin-Auxotrophe mehr Biotin-benötigende Enzyme in ihren Stoffwechselnetzwerken aufweisen (Abb. 3b). Ob eine erhöhte Anzahl biotinabhängiger Enzyme eine Speicherstrategie in Bakterien darstellt, muss noch getestet werden, wird aber durch eine aktuelle Studie gestützt, die zeigte, dass biotinbindendes Rhizavidin bei der Biotinspeicherung für Rhizobium spp. dient [52].

Auxotrophie tritt in der Evolution häufig auf, und in dieser Studie haben wir Auxotrophe in allen wichtigen Phyla innerhalb der Blattmikrobiota von A. thaliana identifiziert. Darüber hinaus beobachten wir in dieser Studie (Abb. 4–6, ergänzende Abb. 8) in Übereinstimmung mit anderen Studien, dass Auxotrophe auch in vitaminfreien Co-Kulturen mit Prototrophen bestehen bleiben [12, 14, 16]. Diese Beobachtungen werfen die Frage auf, ob Auxotrophe eine bestimmte Rolle bei der Bildung mikrobieller Gemeinschaften spielen. Metabolische Unähnlichkeit kann, zumindest theoretisch und im Fall einiger Aminosäuren, zu einer gegenseitigen Fütterung führen [26]. Unsere Ergebnisse stützen diese Idee, da wir feststellen, dass sich Auxotrophe und Prototrophe metabolisch und phylogenetisch voneinander unterscheiden. In dieser Studie haben wir bestätigt, dass Auxotrophe ihre Population auch in Abwesenheit von Vitaminen gut halten, da sie zusammen mit prototrophen Stämmen kultiviert werden, die ihnen Vitamine liefern. Daher nehmen wir an, dass Auxotrophe so lange im Wachstumsstopp bleiben, bis genügend Vitamine ausgeschüttet werden, um das Wachstum wieder aufzunehmen, und dass dieser Lebensstil den Selektionsdruck auf die effiziente Aufnahme von Stoffwechselnebenprodukten verlagert, die von anderen Stämmen freigesetzt werden.

Wir fanden heraus, dass auxotrophe Stämme in mit Vitaminen ergänzten Co-Kulturen erfolgreicher waren, als aufgrund ihres Wachstums in einzelnen Kulturen zu erwarten war. Ein Verbraucher-Ressourcen-Modell, parametrisiert durch experimentell gewonnene Wachstumsraten- und Ertragsdaten mit einem Kohlenstoff-Querfütterungsterm, hat diese Beobachtung ausreichend erfasst. Da das Wachstum auxotropher Stämme erst wieder aufgenommen werden kann, wenn die Prototrophen genügend Vitamine abgesondert haben, könnte die bevorzugte Verwendung einer zusammen mit dem Vitamin abgesonderten Kohlenstoffquelle den Auxotrophen einen Wettbewerbsvorteil verschaffen. Unsere Ergebnisse und Schlussfolgerungen stimmen mit früheren Ergebnissen überein, bei denen die stabile Koexistenz durch die Implementierung eines unspezifischen Kohlenstoff-Cross-Feeding-Terms in einem Verbraucher-Ressourcen-Modellrahmen erklärt wurde und dass das Wachstum bei solchen Stoffwechselnebenprodukten oft mit dem Wachstum bei Primärkohlenstoff vergleichbar ist Quelle wie Glukose [35]. Unser Rahmen legt nahe, dass eine solche Stoffwechselerleichterung nicht nur die Koexistenz fördert, sondern dass der bevorzugte Verbrauch von Kohlenstoffnebenprodukten auch eine praktikable Strategie zur Vermeidung von Wettbewerbsausschluss darstellen kann. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Auxotrophie Teil eines Lebensstils ist, der auf den Verzehr von Stoffwechselprodukten anderer Bakterien spezialisiert ist, und daher für frei lebende Bakterien, die Teil einer mikrobiellen Gemeinschaft sind, von Vorteil sein kann.

Alle in dieser Studie verwendeten At-LSPHERE-Stämme wurden zuvor veröffentlicht [30]. Alle Wachstumstests wurden bei 28 °C für At-LSPHERE-Stämme und 37 °C für E. coli-Stämme [53] durchgeführt. Die Trübung von Schüttelkolbenkulturen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 595 nm („OD600“) in Halbmikroküvetten (Bio-Greiner) mit einem Biophotometer Plus (Eppendorf) bestimmt. Die Proben wurden entsprechend verdünnt, um die OD-Werte im linearen Bereich zu halten. Für Batch-Kulturen mit kontinuierlicher OD-Überwachung für 96-Well-Platten (TPP-Flachboden) wurde Tecan Infinite M200 Pro mit orbitalem Schütteln mit einer Amplitude von 1 mm verwendet.

Die Mediumbasis war ein Phosphatpuffer (2,4 g/l K2HPO4, 2,08 g/l NaH2PO4·2H2O) mit Mineralsalzen (1,62 g/l NH4Cl, 0,2 g/l MgSO4·7H20). Glucose wurde mit 20 mM und Pyruvat mit 40 mM zugegeben. Für alle Medienkomponenten wurden 10x Stammlösungen hergestellt, in ddH2O gelöst und filtersterilisiert. Vitamine wurden bei Bedarf in den folgenden Konzentrationen ergänzt: D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz 1,05 µM, Biotin 0,41 µM, Riboflavin 1,06 µM, Thiamin · HCl 1,19 µM, Pyridoxal · HCl 0,98 µM, p-Aminobenzoesäure 1,09 µM, Cobalamin 0,14 µM, Liponsäure 0,24 µM, Niacin 1,22 µM, Folsäure 0,23 µM. Alle 20 proteinogenen L-Aminosäuren wurden mit jeweils 0,1 mM ergänzt, außer dass L-Tryptophan und L-Tyrosin mit 0,05 mM ergänzt wurden. Für alle anderen Vitamine und Aminosäuren wurden 1000-fache Vorräte hergestellt, mit Ausnahme von Riboflavin und Tryptophan, für die 100-fache Vorräte hergestellt wurden.

Die lineare Regression der ln-transformierten Daten wurde mit der Funktion linear_regression von sklearn durchgeführt. Datenpunkte, die außerhalb der logarithmisch-linearen Skala lagen, wurden weggelassen. Wachstumsraten wurden nur für Kulturen berechnet, die in der Exponentialphase mindestens zwei Verdoppelungen durchführten.

In Depletionsexperimenten (siehe Abb. 1 und ergänzende Abb. 2) wurde festgestellt, dass das Wachstum von auf vitaminfreiem Medium kultivierten Zellen von der ergänzten Kontrolle abweicht, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind. Es musste ein Verdoppelungsunterschied von mindestens 0,25 in der Gesamtzahl der Verdoppelungen zwischen den Vitamin-freien und Vitamin-supplementierten Kulturen bestehen. Darüber hinaus musste in mindestens zwei der drei Wiederholungen die Wachstumsrate nach dem 0,25-fachen Verdopplungsabstand um 25 % reduziert werden; Im verbleibenden Replikat wurde eine Reduzierung um 10 % als akzeptabel angesehen. Die Lagerung wurde als die Anzahl der Verdoppelungen definiert, die ein Stamm zu diesem Zeitpunkt ohne das Vitamin durchführte. Festes R2A-Medium wurde von Sigma erhalten.

Um alle 224 Bakterien in der At-LSPHERE-Sammlung [30] auf Wachstum in 4 Medien (+Vitamine und Aminosäuren, −Ergänzungsmittel, +Aminosäuren und +Vitamine) zu untersuchen, wurde jeder Stamm in flüssiges R2A aus einem festen R2A geimpft plattieren und bis zur stationären Phase wachsen lassen (24 Stunden). Dann wurden 10 µl einer Vorkultur in der stationären Phase in 190 µl von jedem der 4 Medien für eine Vorkultur über Nacht bei 28 °C auf einem 220-U/min-Schüttler in drei biologischen Replikaten inokuliert. Die Hauptkulturen wurden auf die gleiche Weise beimpft und die OD-Messungen wurden zu zwei Zeitpunkten durchgeführt: t = 0 und t = 24 h. Die OD wurde auf die OD in Kontrollvertiefungen (zellfrei, mit Medium gefüllt) normalisiert. Für das Drop-out-Screening mit 50 Stämmen wurde dasselbe Protokoll mit einigen Änderungen wiederholt. Hier wurden 5 µl einer Vorkultur in der stationären Phase auf R2A in 45 µl jedes der 4 Medien (+Vitamin und Aminosäuren, -Ergänzungen, +Vitamine, +Aminosäuren) und jedes der 30 Drop-out-Medien inokuliert (jede einzelne Verbindung in Quelldaten 1) für die Vorkultur über Nacht und erneut für die Hauptkultur. Alle 24 Stunden wurden 5 µl einer Kultur in der stationären Phase auf feste R2A-Platten übertragen und die Farbe und Morphologie der Kolonien mit bekannten Eigenschaften jedes Stamms verglichen, um Kontaminationen auszuschließen.

Jeder Stamm wurde aus festen R2A-Platten auf einer Platte mit 96 Vertiefungen in biologischen Dreifachansätzen und fünf technischen Replikaten in einem Medium angeimpft, das mit 20 Aminosäuren und 4 Vitaminen angereichert war: Thiamin, Niacin, Biotin und Pantothenat, bei 200 µl Kulturvolumen. Am nächsten Tag wurden Hauptkulturen hergestellt, indem 10 µl jeder Zellkultur in frischem Medium verdünnt wurden. Nach einer Kultur über Nacht wurde das späte exponentielle Stadium erreicht. Die fünf technischen Replikate wurden in einem sterilen 2-ml-Eppendorf-Röhrchen zusammengefasst und zweimal gewaschen, indem das Zellsuspensionsröhrchen zentrifugiert wurde (10.000 U/min, 2 Min.), der Überstand entfernt und das Zellpellet in 1,5 ml sterilem MgCl2 aufgelöst wurde. Nach dem zweiten Waschen wurden die Zellen wie zuvor über einen Zentrifugationsschritt gesammelt und die resultierenden Pellets in 50 µl MgCl2 gelöst. 5 µl der resultierenden Zellsuspension wurden in 195 µl von fünf Medien geimpft, die alle 20 Aminosäuren enthielten und sich durch Vitaminzusätze unterschieden. Eines der Medien war ein Kontrollmedium und es enthielt alle vier Vitamine als Vorkulturmedium. Den anderen vier Medien fehlte jeweils eines der folgenden Vitamine: Thiamin, Biotin, Niacin oder Pantothenat. Das Wachstum wurde dann auf einem Tecan-Plattenlesegerät überwacht (Einzelheiten siehe „Wachstumstests“). Nach jeweils zwei Verdoppelungen wurden die Kulturen entsprechend verdünnt, um ein exponentielles Wachstum im linearen Bereich des Plattenlesegeräts aufrechtzuerhalten.

Rhizobium Leaf68 wurde in einer 20-ml-Kultur in einem Medium mit 20 Aminosäuren und Biotin, Niacin und Pantothenat kultiviert. In der späten exponentiellen Phase (OD~1) wurden die Zellen durch Zentrifugation (10.000 U/min, 2 Minuten) gesammelt, gefolgt von zwei Wasch- und Pelletierungsrunden mit 20 ml sterilem MgCl2 und 10.000 U/min für 2 Minuten. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in 1 ml MgCl2 gelöst. Die Kulturen wurden in vier Schüttelkolbenkulturen mit 100 µl dieses Inokulums beimpft: Eine der Kulturen wurde mit allen drei Vitaminen bzw. einem Drop-Out-Medium für jedes Vitamin ergänzt. Die OD wurde einmal pro Verdoppelung überwacht und das intrazelluläre Metabolom wurde wie folgt beprobt. Die Kulturen wurden in einem schüttelnden Wasserbad bei 28 °C gehalten und das Probenvolumen wurde anhand der OD (1/OD ml) bestimmt. Das ermittelte Volumen der Zellsuspension wurde zur Entfernung des Mediums auf einen auf einem Saugkolben stehenden Filter pipettiert. Auf dem Filter stehende Zellen wurden mit 10 ml dH2O gewaschen, das im Wasserbad bei 28 °C gehalten wurde, und der gewaschene Filter wurde anschließend in einen Schott-Kolben überführt, der 8 ml kalt angesäuerte (–20 °C) Abschrecklösung (3 Teile) enthielt MeCN:1 Teil MeOH:1 Teil 0,05 M Ameisensäure). Nach 10 Minuten wurde die Löschlösung in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt und über Nacht bei –50 °C lyophilisiert. Das resultierende Pulver wurde in 250 µl vorgekühltem dH2O gelöst und bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt.

Die LC-Trennung wurde mit einem Thermo Ultimate 3000 UHPLC-System (Thermo Scientific) bei einer Flussrate von 500 µl min–1 erreicht. Es wurden zwei unterschiedliche Trennmethoden angewendet. Die erste Trennung wurde durch hydrophile Wechselwirkung (HILIC; Aquity UHPLC BEH Amide-Säule [100 × 2,1 mm, 1,7 µm Partikelgröße; Waters]) erreicht, wie in [54] beschrieben. Für die HILIC-Analyse wurden 50 µl der wässrigen Probe getrocknet (SpeedVac) und in MeCN gelöst. Die C18-Umkehrphasentrennung (C18RP) wurde mit einer Kinetex XB-C18-Säule (Partikelgröße 1,7 µm, Porengröße 100 Å; Abmessungen 50 × 2,1 mm2, Phenomenex) erreicht, wie an anderer Stelle beschrieben [55]. Für die Massenanalyse wurde das LC-Gerät an ein Thermo QExactive Plus-Gerät (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt und das Massenspektrometer im positiven und negativen FTMS-Modus mit einer Massenauflösung von 30.000 (m/z = 400) betrieben. Es wurde eine beheizte Elektrospray-Ionisations-Sonde (ESI) mit den folgenden Quellenparametern verwendet: Verdampfer 350 °C; Hilfsgas 5; Ionensprühspannung +3,5 kV, Hüllgas, 50; Spülgas, 0; Hochfrequenzpegel, 50,0; Kapillartemperatur: 275 °C. Zur Analyse der Daten wurde eine gezielte Extraktion von Ionenchromatogrammen mit emzed2 durchgeführt [56]. Retentionszeitfenster wurden auf der Grundlage chemischer Standards bestimmt und ausgewählte Fenster wurden auf das Hintergrundsignal normiert.

Als Vorversuch wurden die KBE-Zahlen pro OD-Einheit mithilfe einer Verdünnungsplattierungsmethode bestimmt. Die Kolonien wurden aus einer Verdünnung gezählt, die eine Bestimmung anhand von 5-µl-Punkten ermöglichte (Ergänzungstabelle 5). Alle 20 Stämme wurden dann von festen R2A-Platten in flüssiges Medium mit 20 Aminosäuren und 10 Vitaminen inokuliert und über Nacht in biologischen Dreifachversuchen in 10 ml Kulturvolumen gezüchtet. Nach der Vorkultur befanden sich alle Stämme in der stationären Phase. Die OD jeder Kultur wurde gemessen und auf 5e8 Zellen pro ml eingestellt. Diese angepassten Kulturen wurden dann zu einem Inokulum kombiniert, in dem jeder Stamm eine Häufigkeit von etwa 1/20 aufwies. Das Inokulum wurde wie im Abschnitt „Probenvorbereitung für die LC/MS-Analyse von Abreicherungsexperimenten“ beschrieben gewaschen. Von jedem Inokulum wurden fünf Sequenzierungsproben entnommen und von jedem Inokulum wurden drei technische Replikate sowohl in mit Vitaminen angereicherten als auch in vitaminfreien Medien beimpft. Das Kulturvolumen betrug 20 ml und man ließ die Kulturen bei 28 °C unter orbitalem Schütteln mit 200 U/min wachsen. Nach 9, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden wurden Proben für die 16S-rRNA-Gensequenzierung und Exometabolomik wie folgt entnommen. Für die 16S-rRNA-Gensequenzierung wurde eine 1-ml-Probe in ein DNA-Extraktionsröhrchen aus dem FastDNA SPIN Kit for Soil überführt. Die Röhrchen wurden zentrifugiert (10.000 U/min, 5 Minuten, 4 °C), die Überstände wurden entfernt und die Röhrchen mit den Zellpellets wurden eingefroren und bis zur Extraktion bei –80 °C aufbewahrt. Für die Exometabolomik wurde 1 ml Kultur in ein 2-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und zentrifugiert (10.000 U/min, 5 Min., 4 °C). 200 µl Überstände wurden in zwei technischen Replikaten auf einer 96-Well-Platte gelagert und bis zur Analyse bei −20 °C gelagert (Einzelheiten siehe „LC/MS-Analyse“).

Die DNA wurde mit dem FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Proben wurden auf DNA-Low-Binding-96-Well-Platten (Frame Star 96, semiskirted) übertragen, die DNA-Konzentration wurde mit doppelsträngigem DNA QuantiFluor (Promega) quantifiziert und auf 1 ng µl−1 normalisiert. Die 16S-rRNA-Gen-Amplikonbibliothek wurde wie folgt generiert. PCR-Amplifikation, Aufreinigung und Barcode-PCR wurden wie in [57] durchgeführt. Die DNA-Konzentration wurde wie oben bestimmt und jede Vertiefung auf 1 ng µl−1 normalisiert. Das gleiche Volumen aus jeder Vertiefung wurde dann zu einer gepoolten 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Bibliothek kombiniert und die Bibliothek zweimal mit AMPure-Magnetkügelchen unter Verwendung eines Perlen-zu-DNA-Verhältnisses von 0,9 gereinigt, um kleine DNA-Fragmente zu entfernen. Die Amplikonlängenverteilung der Bibliothek wurde auf einer 2200 TapeStation mit HS D1000 (Agilent) bewertet, was zu einer effektiven Bibliotheksgröße von 554–643 bp führte. Die Sequenzierung wurde für 12 pM-Proben auf einem MiSeq-Desktop-Sequenziergerät (Illumina) im Genetic Diversity Center Zürich unter Verwendung des MiSeq-Reagenzienkits v.3 (gepaartes Ende, 2 × 300 bp, 600 Zyklen PE) durchgeführt. Denaturierung, Verdünnung und Zugabe von 15 % PhiX zur DNA-Bibliothek wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Benutzerdefinierte Sequenzierungsprimer wurden wie zuvor beschrieben verwendet (30).

Das Genom jedes Stamms wurde durch Abfrage von RefSeq mit den Zugangsnummern in Quelldaten 5 erhalten. Gene wurden mithilfe des Eggnog-Mappers auf COG-Begriffe abgebildet und alle Stämme wurden dann iterativ entweder als auxotroph oder prototroph für jede der folgenden Verbindungen gekennzeichnet: Biotin, Thiamin, Pantothenat, Niacin. Die Analyse beschränkte sich auf COG-Begriffe, für die eine Pfadkartierung bereitgestellt wird (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/pathways/). Anschließend wurde eine Kontingenztabelle basierend auf dem Vorhandensein jedes COG-Begriffs in Auxotrophen bzw. Prototrophen erstellt. An der Kontingenztabelle wurde ein χ2-Test durchgeführt und p-Werte sowie Informationen darüber, in welcher Gruppe die einzelnen COG-Begriffe häufiger vorkamen, gespeichert. Die resultierenden p-Werte wurden anschließend mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert. Für deutlich unterschiedliche COG-Begriffe (q-Wert < 0,05) wurde eine funktionale Anmerkung aus der COG-Datenbank-API (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/api/cog/) abgerufen und biologisch zugeordnet Prozess über KEGG (erhältlich bei Biopython). Die Wirksamkeit der Mehrfachtestkorrektur wurde durch die Generierung von Zufallsmodellen durch Mischen der Auxotrophie-/Prototrophiebezeichnungen bestätigt. Kein COG-Begriff war zwischen zufällig zugeordneten Auxotrophen und Prototrophen signifikant unterschiedlich häufig.

Um Modelle zur Vorhersage der Auxotrophie anhand von COG-Annotationen zu erstellen, haben wir Entscheidungsbaumklassifikatoren basierend auf dem oben dargestellten Merkmalsauswahlprozess oder zufällig ausgewählten COG-Begriffen aus jedem Pfad (500 Randomisierungen) trainiert. Zunächst haben wir den Datensatz von 35 validierten Stämmen mit zusätzlichen 28 Stämmen aus dem in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellten Drop-out-Screen angehängt, um die Stichprobenverzerrung zu verringern. Dieser Gesamtsatz von 63 wurde unter Verwendung von „train_test_split“ in ausgewogene Trainings- und Testdatensätze unterteilt, wobei 40 % der Daten zum Testen verwendet wurden, und Entscheidungsbaumklassifikatoren wurden mit „DecisionTreeClassifier“ aus der sklearn-Bibliothek mit einer maximalen Tiefe von drei Knoten generiert.

Konsumenten-Ressourcen-Modelle wurden angewendet, um den Erfolg von Auxotrophen in Co-Kultur-Experimenten zu analysieren. Verbraucherressourcenmodelle sind Darstellungen der Fülle eines Organismus als Funktion seiner Fähigkeit, eine bestimmte Ressource zu verbrauchen. Hier haben wir ein Verbraucherressourcenmodell angewendet, um die Häufigkeit jedes Bakterienstamms anhand seiner experimentell beobachteten KBE-Zahl (Ergänzungstabelle 5), seiner Wachstumsrate (μ) und seines Ertrags zu bestimmen. Die Tragfähigkeit C für jeden Stamm wurde durch Multiplikation seines experimentell ermittelten Maximalertrags mit der KBE-Anzahl pro OD (Spalte KBE/OD in der Ergänzungstabelle 5) bestimmt. Alle Parameter sind in der Ergänzungstabelle 6 erläutert.

Bei t = 0 wurde die Häufigkeit (KBE/ml) jedes Stammes auf die zu Beginn des Experiments experimentell beobachtete Häufigkeit (die Spalte „KBE/ml“ in der Ergänzungstabelle 7) dividiert durch 4 gesetzt (da die Stämme zum ersten Mal miteinander gemischt wurden). Unter Verdünnung der Häufigkeit jedes Stammes um den Faktor 20 wurde das Inokulum im Verhältnis 1/200 in frisches Medium geimpft und schließlich mit 1000 multipliziert, um die KBE/ml abzuschätzen.

Die Konzentration jedes Stammes wurde dann für jeden Zeitpunkt aktualisiert. Hier wurde die Wachstumsrate des Stammes zunächst anhand der Monod-Kinetik aktualisiert

Dabei wurde angenommen, dass die Substrataffinität Ks proportional zum Ertrag des Stamms (in Bezug auf die OD) ist und durch Division des maximalen Ertrags aller Stämme durch den Ertrag jedes Stamms berechnet wurde. Für jeden Stamm wurde eine gewöhnliche Differentialgleichung formuliert, um die Änderung der Konzentration dieses Stammes zu beschreiben:

Wobei Cstrain die Tragfähigkeit oder Ausbeute dieser Dehnung ist. Diese stammspezifischen Gleichungen wurden an eine ODE gekoppelt, die die Änderung der Glukosekonzentration beschreibt, wobei [Glukose] anfänglich auf 20 mM eingestellt wurde.

Dabei schätzt der erste Teil unter der Summe die Glukoseverbrauchsrate jedes Stammes anhand seiner Wachstumsparameter (Wachstumsrate multipliziert mit 10). Der Gesamtglukoseverbrauch wird dann aus den Verbrauchsraten und der auf die Tragfähigkeit skalierten Zellzahl geschätzt. Die Einheit unter der Summe ist h−1. Das Modell wurde dann mit dem Odeint-Solver von Scipy gelöst.

Bei t∈{24,48,72,96} wurde ein Verdünnungsschritt (1/200) wie folgt simuliert:

Die Tragfähigkeit C wurde für jeden Stamm separat wie oben beschrieben bestimmt. Basierend auf den in Abb. 5 dargestellten Daten schätzten wir, dass die Vitaminkonzentration in Gegenwart prototropher Stämme maximal um das Zehnfache anstieg. Da den Kulturen 1 µM Vitamine zugesetzt wurden, wiederholten wir die oben beschriebene Simulation mit der Tragfähigkeit CStrain für jeden Stamm basierend auf der experimentell ermittelten Ausbeute mit 10 µM Vitaminen (ergänzende Abbildung 9). Für Stämme mit fehlenden Daten wurde stattdessen der durchschnittliche Anstieg der Tragfähigkeit verwendet.

Die zweite Kohlenstoffquelle wurde simuliert, indem ein Sekretionsfluss nur für Stämme festgelegt wurde, deren Wachstumsrate über einem bestimmten Schwellenwert lag (variiert von 0,3 – h bis 0,6 h –1). Der Sekretionsfluss wurde gegenüber der Glukoseaufnahmerate um 50 % verringert. Bei t = 0 ist S2 = 0.

Die Sekretion von S2 in das Medium durch schnell wachsende Stämme wurde daher durch kontrolliert

Die Konzentrationsänderung von [S2] war dann

Die Formel für die Konzentration und Produktionsrate von S2 führte zu einem biologisch realistischen Konzentrationsbereich (~ 5 mM; ergänzende Abbildung 10). Auf der Empfängerseite wurden die Wachstumsraten für S2 wie folgt geschätzt

Für Simulationen, in denen die Auxotrophen und Prototrophen gleichermaßen effizient waren, wurde der Parameter Scaling_factor auf 1/3 gesetzt. Um Auxotrophen effizienter zu machen, wurde der Skalierungsfaktor für Auxotrophen auf 1 gesetzt und für Prototrophen auf 1/3 gehalten. Die Empfindlichkeit für diesen Parameter wurde getestet, indem er im Bereich von 1/2 bis 2 eingestellt wurde. Die Konzentration jedes Stammes wurde wie folgt simuliert:

Dabei wurde \(C_{S_{2,\,Strain}}\) auf 70 gesetzt. Dieser Parameter wurde basierend auf der Erkenntnis festgelegt, dass das Wachstum durch Stoffwechselnebenprodukte mit dem Wachstum durch Glukose vergleichbar sein kann [49].

Die Simulationen wurden für die Zeit t∈{1,2,3,…,120} wiederholt. Bei t∈{24,48,72,96} wurde die Verdünnung wie oben beschrieben simuliert.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Analysen auf einem Windows-Computer mit Python 3.8 über Anaconda3 unter Verwendung benutzerdefinierter Skripte durchgeführt. Die Daten wurden in Pandas-Datenrahmen (V 1.1.3) verarbeitet, für numerische Berechnungen wurde die Numpy-Bibliothek (V 1.20.1) verwendet und lineare Regression und mehrfache Testkorrektur wurden über die Modelle sklearn und stats (V 0.23.0 und V 0.12) durchgeführt. 0) Implementierungen. Für statistische Tests wurden Scipy-Implementierungen (V 1.5.2) verwendet. APIs wurden über Anfragen (V 2.22.0) und KEGG über Biopython (V 1.76) abgefragt. Stoffwechselmodelle wurden mit CarveMe [33] (V 1.2.2) gemäß dem veröffentlichten Tutorial (https://carveme.readthedocs.io/en/latest/usage.html) generiert. Für kontinuierliche Daten wurde je nach Varianz innerhalb jeder Gruppe ein T-Test oder ein Welch-T-Test durchgeführt. Für kategoriale Daten wurden χ2-Tests durchgeführt. Die Anzahl der Wiederholungen (n) und die Art des durchgeführten Tests finden Sie in der jeweiligen Bildunterschrift.

Relevanter Code zur Generierung von Verbraucherressourcenmodellen ist als ergänzendes Material verfügbar. Rohe LC/MS-Metabolomics-Daten für Überstände und Depletionsexperimente sind in MetaboLights https://www.ebi.ac.uk/metabolights/index (Zugangs-ID MTBLS5309) verfügbar. Rohe Sequenzierungsdaten sind im European Nucleotide Archive https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home?show=reads (Zugangs-ID PRJEB55397) verfügbar.

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Wir danken M. Schäfer für die Unterstützung beim Auxotrophie-Screening und der kritischen Lektüre des Manuskripts, C. Vogel für die Bereitstellung der COG-Anmerkungen und Auswertung der phylogenetischen Analysen, S. Pfeilmeier für die Hilfe bei der experimentellen Gestaltung der Co-Kultur-Experimente, D. Demaj und P. Kirner für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der 16S-rRNA-Genbibliothek, T. Stewart und J. Kurmann für ihre experimentelle Unterstützung bei den Vitamintitrationsexperimenten. Wir danken L. Hemmerle, P. Kiefer und P. Keller für hilfreiche Diskussionen und A. Pacheco für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken dem Genetic Diversity Center Zürich und insbesondere S. Kobel für technische Unterstützung und Fachwissen in Bezug auf Sequenzdaten sowie C. Field für die Demultiplexierung von Sequenzdaten. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Fördernummer 310030B_201265) unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die Eidgenössische Technische Hochschule Zürich.

Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich, 8093, Zürich, Schweiz

Birgitta Ryback, Miriam Bortfeld-Miller & Julia A. Vorholt

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BR und JAV haben die Studie entworfen. BR führte die Experimente, Analysen und Modellierungen durch. BR und MB-M führten Co-Kulturexperimente, Probenahmen sowie die Vorbereitung und Sequenzierung der 16S-rRNA-Gen-Amplikonbibliothek durch. BR und JAV haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Julia A. Vorholt.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ryback, B., Bortfeld-Miller, M. & Vorholt, JA Stoffwechselanpassung an Vitamin-Auxotrophie durch blattassoziierte Bakterien. ISME J 16, 2712–2724 (2022). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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Eingegangen: 12. Oktober 2021

Überarbeitet: 13. Juli 2022

Angenommen: 25. Juli 2022

Veröffentlicht: 20. August 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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Natur, Ökologie und Evolution (2022)